蛋白质翻译后修饰是生物体实现功能多样性调控的重要途径。活性氧(ROS,
reactive oxygen
species)参与的信号转导通路主要通过蛋白质活性半胱氨酸的氧化还原化学来实现抗性基因表达的转录调控。中国科学院上海药物研究所杨财广课题组日前揭示了表皮葡萄球菌转录因子AbfR感应ROS氧化,调控抗氧化基因表达的结构基础和分子机制。该论文于1月13日在线发表在《美国化学会志》(Journal
of the American Chemical Society
)上。

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美国芝加哥大学化学系何川课题组与药物所蒋华良课题组合作,针对胸腺嘧啶DNA糖苷化酶及细菌转录因子AgrA在表观遗传与转录调控中的作用开展研究,取得较好进展。研究论文分别于2012年2月及2012年5月在线发表在《Nature
Chemical Biology》及美国科学院院刊《Proceedings of the National Academy
of Sciences》上。

氧化感应因子蛋白质是调控抗氧化基因表达的氧化传感器。半胱氨酸首先被氧化成活泼的次磺酸,接下来可能与小分子量硫化物或者蛋白质中的活性半胱氨酸等形成二硫键。二硫键修饰后可导致转录因子结合DNA区域发生构象变化,影响结合DNA的亲和力,实现抗性基因表达的转录调控功能,从而提高对氧化压力的抵抗能力。二硫键修饰可在还原性条件下回复到最初的硫醇状态。此外,次磺酸还可以被特定的氧化剂氧化为不可逆的过氧化修饰,即亚磺酸和磺酸,其功能与分子机制的研究尚不多见。

蛋白质翻译后修饰是生物体实现功能多样性调控的重要途径。活性氧(ROS,
reactive oxygen
species)参与的信号转导通路主要通过蛋白质活性半胱氨酸的氧化还原化学来实现抗性基因表达的转录调控。中国科学院上海药物研究所杨财广课题组日前揭示了表皮葡萄球菌转录因子
AbfR 感应 ROS 氧化,调控抗氧化基因表达的结构基础和分子机制。该论文于 1
月 13 日在线发表在《美国化学会志》(Journal of the American Chemical
Society)上。

在针对胸腺嘧啶DNA糖苷酶(Thymine-DNA glycosylase,
TDG)底物选择性机制的研究中,两个课题组研究人员综合运用化学生物学,理论模拟等手段,阐明了TDG选择性切除DNA分子中被修饰的嘧啶碱基的分子机制。TDG能选择性剪切由TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶氧化产生的5-醛基胞嘧啶及5-羧基胞嘧啶,继而启动下游DNA剪切修复(BER,base-excision
repair)通路,将5mC还原成未修饰的胞嘧啶。然而TDG如何在众多正常的胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶中选择性切除5caC和5fC的机制并不明确。何川教授课题组通过生物实验发现TDG对于含有不同修饰胞嘧啶的DNA结合能力有显著不同,其与含有5caC和5fC的DNA结合能力最强,而与含5hmC,5mC及正常胞嘧啶的DNA几乎不结合。蒋华良课题组成员从计算生物学的角度出发,根据何川课题组解析得到的TDG与5caC的复合物晶体结构,开展了分子动力学模拟与结合自由能计算研究。通过计算发现,TDG活性口袋的Ile139可以和5caC形成较强的氢键相互作用,而同5mC和正常胞嘧啶不存在此相互作用。另外,TDG活性口袋中的His151,Tyr152同5caC的5位羧基存在很强的极性相互作用,而与其它修饰的胞嘧啶如5mC和5hmC相互作用较弱。因此可以认为TDG的活性口袋能选择性的结合5位具有负电性取代基的底物,如5caC或5fC。研究结果为进一步阐明TDG在表观遗传调控中扮演的作用提供了重要线索。

上海药物所杨财广、蓝乐夫课题组早期合作研究发现表皮葡萄球菌感应ROS的转录调节因子AbfR属于MarR家族成员(J.
Biol. Chem
. 2013, 288,
3739-3752),其显著特点是通过二硫键化学改变蛋白质的构象。AbfR通过传感器半胱氨酸Cys13和别构半胱氨酸Cys116间发生分子间的二硫键氧化修饰,感知氧化应激,解除对下游抗氧化基因的转录阻遏。理论上,AbfR的氧化化学可以形成二硫键以及过氧化修饰,杨财广指导博士研究生刘桂杰和刘幸对此继续展开深入探索。

氧化感应因子蛋白质是调控抗氧化基因表达的氧化传感器。半胱氨酸首先被氧化成活泼的次磺酸,接下来可能与小分子量硫化物或者蛋白质中的活性半胱氨酸等形成二硫键。二硫键修饰后可导致转录因子结合
DNA 区域发生构象变化,影响结合 DNA
的亲和力,实现抗性基因表达的转录调控功能,从而提高对氧化压力的抵抗能力。二硫键修饰可在还原性条件下回复到最初的硫醇状态。此外,次磺酸还可以被特定的氧化剂氧化为不可逆的过氧化修饰,即亚磺酸和磺酸,其功能与分子机制的研究尚不多见。

在转录因子AgrA调控机制的研究中,两个课题组进一步合作,阐明了细菌转录因子AgrA的DNA结合域中分子内二硫键的开关在群体感应agr信号系统中发挥的重要功能。何川课题组前期研究发现,在氧化信号刺激下,AgrA结构中C199和C228会形成分子内二硫键,导致AgrA与DNA的解离。蒋华良课题组成员从计算生物学角度出发,运用分子动力学模拟等手段从分子水平揭示,二硫键的形成引起的空间位阻效应是破坏AgrA与DNA的结合的重要原因。同时,C199S的突变不会影响蛋白结构的稳定性,而C228S的突变破坏了DNA结合域的三维结构,暗示C199主要负责氧化感应,而C228对于维持蛋白结构的稳定性至关重要。模拟结果与相关突变实验结果相吻合,证实了氧化感应是agr群体感应信号系统中的一个重要组分,细菌通过这种功能调节,可以有效缓解由其自身代谢或宿主免疫造成的氧化压力。研究结果为深入理解细菌转录调控机制及新型抗菌药物的开发提供重要依据。

该研究首先表征了过氧化修饰AbfR的功能与机制。质谱学实验确证,AbfR除了分子间二硫键修饰外,传感器半胱氨酸Cys13还发生过氧化修饰,即生成亚磺酸和磺酸。晶体结构显示过氧化修饰AbfR整体构象与还原态AbfR高度类似,基本保留了结合启动子DNA的能力,保持对抗氧化基因的转录阻遏。虽然AbfR过氧化修饰直接“原位”消耗氧,预期可以作为缓解氧化压力的一种机制,但是过氧化的AbfR并没有解除对抗氧化基因的转录阻遏。事实上,研究没有检测到具有生物学意义浓度的过氧化修饰的AbfR在表皮葡萄球菌中的存在,预示过氧化修饰可能不是AbfR感应氧化胁迫的有效途径。

上海药物所杨财广、蓝乐夫课题组早期合作研究发现表皮葡萄球菌感应 ROS
的转录调节因子 AbfR 属于 MarR 家族成员(J. Biol. Chem. 2013, 288,
3739-3752),其显着特点是通过二硫键化学改变蛋白质的构象。AbfR
通过传感器半胱氨酸 Cys13 和别构半胱氨酸 Cys116
间发生分子间的二硫键氧化修饰,感知氧化应激,解除对下游抗氧化基因的转录阻遏。理论上,AbfR
的氧化化学可以形成二硫键以及过氧化修饰,杨财广指导博士研究生刘桂杰和刘幸对此继续展开深入探索。

该合作团队有机结合生物实验与计算模拟,积极探索表观遗传与转录调控的相互联系,以及它们在胚胎发育与疾病产生中扮演的作用。为进一步靶向新的表观遗传与转录调控靶标,开发高效特异的小分子活性候选化合物提供了理论基础。

该研究进一步确定了单二硫键氧化修饰AbfR的生物学功能和分子机制。AbfR生成二硫键的氧化化学是分步发生的,两个单体的半胱氨酸Cys13和Cys116之间首先发生分子间单二硫键交联,在强氧化条件下进一步生成双二硫键交联。与还原态AbfR相比,单二硫键交联修饰已经足够使AbfR结合DNA的功能减退,而双二硫键修饰进一步促使AbfR从DNA上解离。单二硫键交联和双二硫键交联修饰导致AbfR功能性失活,解除了对下游抗氧化基因的转录阻遏,从而增强对宿主免疫系统等氧化胁迫的抵抗能力。晶体结构显示,与还原型AbfR相比,二硫键修饰的AbfR采用了一种“开放式”的构象,不再适合识别并结合DNA的大沟和小沟。研究回答了AbfR为什么通过二硫键修饰,而不是过氧化修饰来感应氧化胁迫,调控抗性基因表达。

该研究首先表征了过氧化修饰 AbfR 的功能与机制。质谱学实验确证,AbfR
除了分子间二硫键修饰外,传感器半胱氨酸 Cys13
还发生过氧化修饰,即生成亚磺酸和磺酸。晶体结构显示过氧化修饰 AbfR
整体构象与还原态 AbfR 高度类似,基本保留了结合启动子 DNA
的能力,保持对抗氧化基因的转录阻遏。虽然 AbfR
过氧化修饰直接“原位”消耗氧,预期可以作为缓解氧化压力的一种机制,但是过氧化的
AbfR
并没有解除对抗氧化基因的转录阻遏。事实上,研究没有检测到具有生物学意义浓度的过氧化修饰的
AbfR 在表皮葡萄球菌中的存在,预示过氧化修饰可能不是 AbfR
感应氧化胁迫的有效途径。

仅三年来,两个课题组通力合作,在表观遗传分子机制和相关药物发现研究中取得一系列进展,除上述两项合作外,其他合作正在进行中。这些合作研究,促进了药物所表观遗传研究。合作研究得到了NIH、中科院“干细胞与再生医学”战略先导专项、973、863以及上海市科委“非政府间国际合作”项目的部分资助。

研究工作得到了国家自然科学基金委、国家重点研发计划等资助,以及上海同步辐射光源的支持。

该研究进一步确定了单二硫键氧化修饰 AbfR 的生物学功能和分子机制。AbfR
生成二硫键的氧化化学是分步发生的,两个单体的半胱氨酸 Cys13 和 Cys116
之间首先发生分子间单二硫键交联,在强氧化条件下进一步生成双二硫键交联。与还原态
AbfR 相比,单二硫键交联修饰已经足够使 AbfR 结合 DNA
的功能减退,而双二硫键修饰进一步促使 AbfR 从 DNA
上解离。单二硫键交联和双二硫键交联修饰导致 AbfR
功能性失活,解除了对下游抗氧化基因的转录阻遏,从而增强对宿主免疫系统等氧化胁迫的抵抗能力。晶体结构显示,与还原型
AbfR 相比,二硫键修饰的 AbfR
采用了一种“开放式”的构象,不再适合识别并结合 DNA
的大沟和小沟。研究回答了 AbfR
为什么通过二硫键修饰,而不是过氧化修饰来感应氧化胁迫,调控抗性基因表达。

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研究工作得到了国家自然科学基金委、国家重点研发计划等资助,以及上海同步辐射光源的支持。

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上海药物所揭示氧化感应因子AbfR的作用机制

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